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質(zhì)膜的液態(tài)二相離心分離
更新時(shí)間:2011-07-08   點(diǎn)擊次數(shù):1379次
用葡聚糖(Dextran)和聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)二相不連續(xù)梯度分離純化動(dòng)植物樣品的細(xì)胞膜片斷(特別是質(zhì)膜)的方法始于1989年(文獻(xiàn)1)。這種方法的特點(diǎn)是快速,操作簡單,重復(fù)性好。只需要低速離心機(jī)(4,000rpm),分離成本低。
用PEG和Dextran 混合后再加入樣品,低速離心后形成上下二個(gè)液體相,體積相近。上液體相中對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞的亞細(xì)胞構(gòu)造的排列,順序是(自下而上),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)<線粒體<溶酶體<高爾基體<質(zhì)膜;對(duì)于植物細(xì)胞其排列順序(自下而上)是:破碎的類囊體<完整的葉綠體<糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)<線粒體,過氧化酶體<液泡膜<滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)<類囊體<高爾基體<溶酶體<質(zhì)膜。
 
常用的方法是:組織勻漿先以低速離心(甩平轉(zhuǎn)頭,500g,3min)去除沒有破碎的整細(xì)胞及其他組織碎片。上清液與Dextran 及PEG 混合后再低速離心(3,000xg,15min)形成二個(gè)液體相。
 
離心方案:
1. 原液制備:
   Dextran (20%w/w):220克 Dextran T-500 (Pharmacia 產(chǎn)品) 溶于780克純水,電磁攪拌器加熱(40℃)并攪拌至全部溶解。
   PEG(3350,Union Carbide 公司出品,或相應(yīng)產(chǎn)品)300克溶于1升水。
2. 制備液體二相:取200克,20% Dextran ,103克PEG原液,33ml 0.2M Na3PO4 (PH6.5)和179ml 純水在量筒中充分混合,靜置過夜形成二相液體,PEG在上,Dextran 在下。可以看到明顯的分界面,中間有較窄的隔離帶。分別取出二液態(tài)相備用(Dextran下相包含隔離帶)
3. 用合適的方法將含有107--108 個(gè)細(xì)胞的動(dòng)、植物組織制備成勻漿,用低速小型冷凍離心機(jī)水平轉(zhuǎn)頭(如Hitachi CF-RX 系列離心機(jī),T5SS31 甩平轉(zhuǎn)頭或 CF-7D2 離心機(jī)T5SS 轉(zhuǎn)頭,zui大容量 4×250ml 單管容量從5ml 到 250ml,用戶可按實(shí)際情況選用不同容量的離心管。也可以用其他品牌離心機(jī)和相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)
4. 勻漿在500g (約1,600rpm)4℃離心3分鐘去除沒有裂解的細(xì)胞和組織(在沉淀中)
5. *次離心后的上清液在3,000xg (約4,100rpm)4℃ 離心15分鐘,保留沉淀。
6. 將第二次離心后的沉淀加入尚未形成二相的Dextran--PEG 混合液(第2步前段),充分混合。2,000xg(約3,300rpm), 4℃離心10分鐘。離心后仍保持4℃。等待形成明顯的二個(gè)液態(tài)相(有隔離帶),亞細(xì)胞構(gòu)造分布于二個(gè)液態(tài)相之中。
7. 分別收集(6) 離心后形成的二個(gè)含有亞細(xì)胞構(gòu)造的液態(tài)相備用(上相和下相,下相包含隔離帶)
8. 根據(jù)容量選擇合適的離心管(常用50ml 帶蓋圓底管),*類離心管下部是(2)中形成的Dextean液態(tài)相和隔離帶;上部是(7)中用水稀釋(3—5倍)的上相。上、下部體積比為6:4。
9. 第二類離心管下部是(7)中離心后的下相(包含隔離帶),上部是(2)中制備的PEG液態(tài)相,上、下部液體的比例為4:6
10. 以上二類離心管,分別用上下顛倒30—40次的方法充分混合后分別離心(3,000xg,約4,100rpm,4℃,10分鐘)
11. *類離心管離心后上部液態(tài)相中主要含質(zhì)膜片斷,下部為其他亞細(xì)胞構(gòu)造
12. 第二類離心管離心后上部及隔離帶中主要含質(zhì)膜片斷,下部為其他亞細(xì)胞構(gòu)造
 
討論:
1. 不同的組織,分離質(zhì)膜的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間及PH值各有差異,可以從實(shí)驗(yàn)中摸索,優(yōu)化。
2. 離心后其他亞細(xì)胞構(gòu)造可以用文獻(xiàn)中介紹的其他方法進(jìn)一步分離純化(例如用Percoll,Nycodenz,metrizamide作自形成梯度分離)
 
參考文獻(xiàn):
1. Fisher. D. and Sutherland, I.A.  “Separations using aqueous phase system”—Applicaion In cell biology and biotechnology . plenum press , New York .1989
2. W . Howard  Evans  “Isolation and characterization of membranes and cell organelles”, from “Centrifugation” Edited by David Rickwood,Oxford  Univ. press 1992
3. Presson  A. 等      Biochem . J .  vol:273  P173 (1991)
注:本文主要內(nèi)容摘自文獻(xiàn)(2)

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